Márquez conseguiu o melhor tempo no último momento do treino, superando o italiano Fabio Quartararo (Yamaha), apontado como a grande revelação da temporada, com 1min45s733. Outros dois italianos vieram na sequência: Danilo Petrucci, da Ducati, com 1min45s881, e Franco Morbidelli (Yamaha), com 1min45s959.
O australiano Jack Miller, com Ducati, ficou em quinto lugar, ao marcar o tempo de 1min46s029, seguido pelo britânico Cal Crutchlow (Honda), com 1min46s079. A terceira fila ficou com o espanhol Maverick Viñales (Yamaha), com 1min46s181, no sétimo lugar. O italiano Francesco Bagnaia (Ducati) ficou em oitavo lugar (1min46s260, à frente do compatriota Andrea Dovizioso (Ducati), vice-líder do campeonato, que fez a sua melhor volta em 1min46s293. O décimo lugar foi do japonês Takaaki Nakagami (Honda), com 1min46s387.
O espanhol Alex Rins, terceiro colocado no Mundial, foi apenas o 13º mais rápido com sua Suzuki, ao marcar 1min46s539.
Márquez, que somou a quarta pole em seis tomadas de tempo oficiais no ano, lidera a classificação do campeonato com 95 pontos, contra 87 de Dovizioso. Rins tem 75, enquanto Rossi soma 72. A prova em Mugello é a sexta da temporada, que conta com 19 corridas..